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质粒DNA的大量提取、纯化及棉花的遗传转化
  • 发布日期:2016-01-22     信息来源:      浏览次数:2245
    • 实验试剂
      1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)]
      2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)]
      3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混匀)
      4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8)
      5. 异丙醇
      6. 4 mol/L LiCI
      7. RNase
      8. 苯酚、酚-氯仿、氯仿
      9. 乙醇
      实验设备
      1. 摇床
      2. 制冰机
      3. 高速离心机
      4. 水浴锅
      5. 超净工作台
      6. 玻璃毛细管
      7. 微量注射器
      实验材料
      棉花,转化农杆菌菌株
      实验步骤
      1. 37℃, 250 rpm摇菌500 ml。
      2. 5000 × g离心5 min以收集菌体,用50 ml STE洗涤菌体一次。
      3. 加入溶液I 20 ml悬浮菌体。
      4. 加溶液II40 ml,轻轻将离心管颠倒几次,置冰浴20 min。
      5. 加预冷的溶液III30 ml,将离心管颠倒几次,置冰浴10 min以上。
      6. 10000 × g离心15 mm,取上清液加入0.6倍体积的的异丙醇,充分混匀后室温放置10 min以上。
      7. 10000 × g离心10 min,弃上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解,加350 ul 4 mol/L LiCI,混匀后室温放置10 min以上。
      8. 10000 × g离心5 min,取上清液加入RNase至终浓度为100 ug/ml,37℃保温2h。
      9. 用苯酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。上清加0.1倍体积的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍体积的无水乙醇。
      10. 离心收集DNA沉淀,70%乙醇洗涤一次。干燥后溶于TE中备用。
      11. 棉花的遗传转化:大量的质粒,用无菌水稀释成2 mg/ml的DNA溶液进行子房注射。注射在超净工作台上进行,注射针是玻璃毛细管,顶端直径约为0.1mm。将毛细管另一端紧紧套入10-20ul的微量注射器针头,汲取被注射的DNA样品6-12ul。注射时,将针头对准子房伸出的花丝部分进行。每个子房约注射0.2ulDNA。

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