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紫外分析仪检测乳和乳粉中黄曲霉毒素M1
  • 发布日期:2016-04-20     信息来源:      浏览次数:2298
    • ICS 67.100.10
      X 04
      GB/T 18980-2003
      乳和乳粉中黄曲霉毒素M,的测定
      免疫亲和层析净化液相色谱法
      和 荧 光 光 度 法
      Determination of aflatoxin M1 content in milk and milk powder-
      Cleanup by immunoaffinity chromatogaphy and determination by
      hig h- pe rformancel iquidc hromatigraphya ndf luorometer
      (ISO 14501:1998,IDT)
      2003-02-21发布2003-08-01实施
      中华人民共和国
      国家质量监督检验检疫总局发布
      GB/T 18980-2003
      前言
      本标 准 的 免疫亲和层析净化一液相色谱法等同采用ISO1 4501;1998《乳和乳粉中黄曲霉毒素
      M 免疫亲和层析净化液相色谱法》。
      本标 准 免 疫亲和层析净化一荧光光度法快速测定乳和乳粉中黄曲霉毒素M,o
      本标 准 中 的附录A为资料性附录
      本标 准 由 北京市质量技术监督局提出。
      本标 准 由 全国食品工业标准化技术委员会归口。
      本标 准 起 草单位:北京市产品质量监督检验所、青岛出人境检验检疫局、国家标准物质研究中心。
      本标 准 主 要起草人:王晶、张鹏、张艺兵、邵明武。
      本标 准 为 发布。
      GB/T 18980-2003
      乳和乳粉中黄曲霉毒素M,的测定
      免疫亲和层析净化液相色谱法
      和荧 光 光 度 法
      免疫亲和层析净化液相色谱法
      1. 1 范围
      本标 准 适 用于乳、乳粉,以及低脂乳、脱脂乳、低脂乳粉和脱脂乳粉中黄曲霉毒素M,含量的测定。
      乳粉中的zui低检测限是。.08 pg/kg,乳中的zui低检测限是。.008 pg/l
      1.2 术语和定义
      下列 术 语 和定义适用于本标准。
      1.2. 1
      黄曲 碑 毒 索M,含, at7atoxinM ,co ntent
      通过 本 标 准所测定出的本物质的质量含量。
      注 :黄 曲 霉毒素M、的含量以微克/升伽g/L)或微克/千克(fig/kg)表示。
      1. 3 原理
      试样 通 过 免疫亲和柱时,黄曲霉毒素M 被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M、特异性单克隆
      抗体交联在固体支撑物上,当样品通过亲和柱时,抗体选择性的与黄曲霉毒素M,(抗原)键合,形成抗
      体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质,然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M,,收集洗脱
      液。用带有荧光检测器的液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M,含量
      1.4 试荆
      除非 特 别 声明,所用试剂为分析纯;使用蒸馏水、去离子水或其他相当纯度的水。
      1.4.1 免疫亲和柱:应该含有黄曲霉毒素M 的抗体。亲和柱的zui大容量不小于100 ng黄曲霉毒素
      M,(相当于50 ml浓度为2 pg/l的试样),当标准溶液含有4 ng黄曲霉毒素M,(相当于50 mL浓度为
      80 ng/l的试样)时回收率不低于80 。应该定期检查亲和柱的柱效和回收率,对于每个批次的亲和柱
      至少检查一次(见1.4.1.1和1.4.1.2)
      1.4.1.1 柱效检查
      用移 液 管 (1.5.4)移取1.0m 工_的黄曲霉毒素M,储备液(1.4.5.2)到20m L的锥形试管中
      (1.5.9)。用恒流的氮气(1.4.3)将液体慢慢吹干,然后用10 ml. 10%的乙睛(1.4. 2.2)溶解残渣,用力
      摇荡。
      将该 溶 液 加人到40m L的水中,充分混匀,全部通过免疫亲和柱。按说明书要求使用免疫亲和柱。
      淋洗免疫亲和柱后,洗脱下黄曲霉毒素M,。将洗脱液进行适当稀释后,用液相色谱仪测定免疫亲
      和柱键合的黄曲霉毒素M,含量。
      计算 黄 曲 霉毒素M,的回收率,将其结果与1.4.1中所要求的指标进行比较。
      1.4.1.2 回收率检查
      用移 液 管 (1.5们移取。.8 m l。005p g/ml的黄曲霉毒素Ml标准工作液(1.4.5.3)到10m L的
      水中,充分混匀,全部通过免疫亲和柱。按说明书使用免疫亲和柱。淋洗免疫亲和柱,洗脱下黄曲霉毒
      素M:。将洗脱液进行适当稀释后,用液相色谱仪测定免疫亲和柱键合的黄曲霉毒素M,含量。计
      GB/T 18980-2003
      算黄曲霉毒素M,的回收率,将其结果与1.4. 1中所要求的指标进行对比。
      1.4.2 乙睛:色谱级
      1.4.2.1 25%乙睛一水溶液:将250m L的乙睛(1.4.2)与750m l的水混溶(使用前需要脱气)。
      1.4.2.2 10%乙睛一水溶液:将100m L的乙睛(1.4.2)与900m L的水混溶(使用前需要脱气)。
      1.4.3 氮气。
      1.4.4 三抓甲烷:加人。.5%^-1.0%质量比(与三抓甲烷质量比)的乙醇进行稳定。
      1.4.5 黄曲霉毒素M:标准溶液
      1.4.5. 1 校准溶液
      黄曲 霉 毒 素M:三抓甲烷溶液标称浓度为10p g/mL。根据下面的方法,在zui大吸取波段处测定溶
      液的吸光度,以确定黄曲霉毒素M,的实际浓度。
      用分 光 光 度计(1.5.11)在340n m^-370n m处测定,扣除三抓甲烷的空白本底,读取标准溶液的吸
      光度值。在接近360 nmzui大吸取波段A、二处,测得吸光度值为A,根据式(1)计算出浓度值
      c, (Pg/mL),
      ..
      ‘ = A X M X 1 00 /e · ··· ··· ·· ·· ··· ··· ··· ··· ··· ··· · ··· ·? ? ( 1 )
      式 中 :
      A— 在 3m.:处测得的吸光度值;
      M- - 32 8g /mol,黄曲霉毒素M,摩尔质量,单位为克每摩尔(g/mol);
      E- 19 95,溶于三抓甲烷中的黄曲霉毒素M,的吸光系数,单位为平方米每摩尔(m'/m ol),
      1.4.5.2 标准储备液
      确定 黄 曲 霉毒素M;标准溶液的实际浓度值后(1.4.5.)1,继续用三抓甲烷将其稀释至浓度为
      0.1 u g/mI一的储备液。储备液密封后于冰箱中5℃以下避光保存。在此条件下,储备液可以稳定两个
      月。两个月后,应该对储备液的稳定性进行核查。
      1.4.5.3 黄曲霉毒素M,标准工作液
      从冰 箱 中 取出储备液(1.4.5.2)放置至室温,移取一定量的储备液进行稀释制备成工作液。工作液
      当天使用当天制备。
      黄曲 霉 毒 素M,标准工作液配制:用移液管(1.5. 4) 准确移取1.0 m L的储备液(1.4. 5. 2)到20m L
      的锥形试管中(1.5.9),用和缓的氮气(1.4.3)将溶液吹干,然后用20.0 m L1 0%的乙睛(1.4.2.2)将残
      渣重新溶解,30m in内振摇、混匀,配成浓度为。.00 5j g/mI的黄曲霉毒素M;标准工作液。在用氮气
      对储备液吹干的过程中,一定要仔细操作,不能让温度降低太多而出现结露。
      在作 标 准 曲线时,黄曲霉毒素M,的进样量分别为。.05n g,0.1 n g,0.2 n g和。.4 n g。根据液
      相色谱仪进样环的容积量,用工作液配制一系列适当浓度的黄曲霉毒素M,标准溶液,稀释液用10%乙
      睛(1.4.2.2)
      5 仪骼及材料
      便用 实验室通用仪器设备,特殊仪器及材料说明如下
      1,5. 1
      1.5.2
      1.5.3
      1.5.4
      1.5.5
      1.5.6
      1.5.7
      1.5.8
      1.5.9
      1.5. 10
      一次性注射器:10 mL和50 mL,
      真空系统。
      离心机:40 00g 离心力(离心力g=1.12 X 1 0-,X 转/分X旋转半径)。
      移液管:1.0m L,2.0 m l和50.0 M L,
      玻璃烧杯:250 mLo
      容量瓶:100 mLe
      水浴
      滤纸
      :温控30℃士2',50℃士20C,温度范围350C---370C,
      带刻度的磨口锥形玻璃试管:5 mL,10 mL,20 mI。
      液相色谱仪
      GB/T 18980-2003
      1.5. 10.1 无脉冲泵:适合恒定体积流量约1 mL/min的泵
      1.5. 10.2 进样系统:具有固定或可变容积的进样环,进样体积50川--500 pL.
      1.5. 10.3 反相色谱柱:填充3 um或者5 km的十八烷基硅胶,加有填充反相材料的保护柱。
      1.5. 10 .4 荧光检测器:具有365n m激发波长、435n m发射波长,在适当的色谱条件下能够测定
      0. 02 ng的黄曲霉毒素M,(相当于5倍噪音)。
      1.5. 10.5 记录仪:带打印机或绘图仪、电子积分仪或计算机数据处理系统。
      1.5. 1 1 分光光度计:波长范围为200n m--400n m,带光径长度为1c m的石英比色池。
      1.5. 12 天平:准确至。.1g,zui小分度。.01 go
      1.6 采样
      采样 方 法 不属于本标准叙述的范围,推荐的采样方法请参见ISO7 07[1]a
      实验 室 收 到的样品应该具有真正的代表性,在运输和储藏的过程中没有被损坏和改变。
      1.7 分析步骤
      1.7. 1 概述
      所有 的操 作分析均应尽可能在避光条件下进行。
      使用 不 同 厂商的亲和柱,在乳粉的制作、洗涤和洗脱的操作方面可能略有不同,应该严格按照说明
      书要求进行操作。通常的分析步骤包括:用水或者盐水缓冲液将乳粉冲制成乳,离心分离后在一定压力
      过柱(可能需要预洗),用水洗柱,并用甲醇或乙睛洗脱吸附在柱上黄曲霉毒素M,。严格按照规定的流
      速进行操作。
      1.7.2 制备试样
      1.7.2. 1 乳
      将乳 样 品 在水浴(1.5 .7) 中加热到350C-370C。用滤纸(1.5.8)过滤(根据情况,也许需要用几张
      滤纸进行过滤),或者在4 000 g离心力下离心15 min。至少收集50 mL乳试样,按照1.7.4继续进行
      分析。
      1.7.2.2 乳粉
      称取 10 g样品(到0.1 g ),置于250m L的烧杯(1.5.5)中。将50m L已预热到50℃的水多次
      少量地加人到乳粉中,用搅拌棒将其混合均匀。
      如果 乳 粉 不能*溶解,将烧杯在50℃的水浴(1.5. 7)中放置至少30m in,仔细混匀。
      将溶 解 的 乳粉冷却至20℃后,移人100m l容量瓶(1.5.6 ) 中,用少量的水分次淋洗烧杯,淋洗液一
      并移人容量瓶中,再用水定容至刻度。用滤纸(1.5.8)过滤乳,或者在4 000 g离心力下离心15 min,
      至少收集50 ml_的乳试样,按照1.7.4继续进行分析。
      1.7.3 免疫亲和柱的准备
      将一 次 性 的50m L注射器筒(1.5.1)与亲和柱(1.4.1)的顶部相连,再将亲和柱与真空系统
      (1.5.2)连接起来。
      ,.7.4 样品的提取与纯化
      用移 液 管 移取50m L试样(1.7.2.1或1.7.2.2)到50m L注射器(1.5.1)中,调节真空系统
      (1.5.2),控制试样以Zm工一min-3 ML/min稳定的流速过柱。
      取下 50 M I的注射器,装上10m L注射器。注射器内加人10M I水,以稳定的流速洗柱,然后,抽
      干亲和柱。
      脱 开真 空 系统,装上另一个10m L注射器,加人4m L乙睛(1.4.2),缓缓推动注射器栓塞,通过柱
      塞控制流速,洗脱黄曲霉毒素M,,洗脱液收集在锥形管(1.5.9)中,洗脱时间不少于60 s。然后用和缓
      的氮气(1.4.3)在30℃下将洗脱液蒸发至体积V。为50 1,L-500 pL(警告:如果蒸发至干,会损失黄曲
      霉毒素M,)。用水将V。稀释10倍至zui终体积为V,(即500 pL-5 000 VI)。
      注:如果注人液相色谱仪含黄曲霉毒素M 的样品,乙睛含量超过10肠,色谱峰变宽。如果水含量超过90%
      则 对 色 谱峰的形状没有影响。
      cs/T 18980-2003
      1.7.5 液相色谱分析仪
      1. 7.5.1 泵
      以t ra定 流 速 将 乙睛一水溶液(1.4.2.1)泵流通过液相色潜柱。如果需要(根据所用色谱柱的型
      号),调整乙睛一水的比例,以保证使黄曲霉毒素M,与其他成分的分离效果*。
      乙睛 水 溶 液 (1.4.2.1)的体积流速根据所用色谱柱(1.5. 10 .3 ) 而定对于普通色谱柱(柱长约
      25 cm,柱内径约4. 6 mm)而言,流速在1 ml-/min左右,效果;柱内径为3 mm时,流速在
      。.5 mL·min左右,效果
      为 了确 定 *的色谱条件,先将不含黄曲霉毒素M,的阴性样品提取液注人HPLC,然后再注
      人样品提取液与黄曲霉毒素M 标准溶液的混合液
      1.7.5.2 色谱性能
      标准 曲 线 的线性度和色谱系统的稳定性需要经常检查,多次反复地注人固定量的黄曲霉毒素M,
      标准溶液,直至获得稳定的峰面积和峰高。相邻两次峰面积和峰高的差异不得超过5%e
      黄曲 霉 毒 素M,的保留时间与温度有关,所以对测定系统的漂移需要补偿。每隔一段时间测定固
      定量的黄曲霉毒素M,标准溶液,这些标准溶液的测定结果可以根据漂移的情况进行校正。
      1.7.5.3 黄曲.毒索M:的标准曲线
      根据 HP LC进样环容积,选择适当体积数V,,分别注人含有。.05n g,0.1 n g,0.2n g和0.4 n g的
      黄曲霉毒素M 标准溶液。绘制成峰面积或峰高对黄曲霉毒素M,质量数的标准曲线。
      1.7.5.4 样品洗脱液的色谱分析及进样方案
      通过 进 样 环将适量体积V.洗脱液注人液相色谱仪。采用与标准溶液相同的色谱条件分离出
      洗脱液中的黄曲霉毒素M,。标准溶液和样品洗脱液均按照规定的方案进样。当连续检测一系列样品
      时,建议每隔五个样品,加测一个黄曲霉毒素M,标准溶液。
      根 据 样 品洗脱液色谱图中黄曲霉毒素M,的峰高或峰面积值,从标准曲线上得出样品洗脱液中所
      含有的黄曲霉毒素M 质量数(ng).
      如果 样 品 洗脱液的黄曲霉毒素M,的峰面积或峰高值高于标准溶液,用水定容稀释样品洗脱液后,
      重新进样分析。
      1.8 测定结果的计算与表示
      1.8. 1 乳
      应用 式 ( 2)计算被测样品中的黄曲霉毒素M,的含量wme
      wm = M nX ( V, /V )X ( 1/ V) ··· ··· ··· ···· ··· ···· ··· ···· ? ? (2 )
      式 中 :
      w一 下 黄 曲霉毒素M的含量,单位为微克每升(Pg/1.);
      MA - 一 样品洗脱液黄曲霉毒素M 的峰面积或峰高从标准曲线上得出的黄曲霉毒素M 的质量
      数, 单 位 为纳 克 ( ng );
      V; 止 样 品洗脱液的体积数,单位为微升(f4L);
      V -一 样 品洗脱液的zui终体积数,单位为微升(川_);
      V- 一 通 过 免 疫亲和柱被测样品的体积数,单位为毫升(ML)o
      计 算结 果 表示到小数点后三位。
      1.8.2 叨姗
      应用式(3)计算被测样品中的黄曲霉毒素M,的含量woo
      w。二m X(v/v.)X (1/m) ···························??(3)
      w=C'l-p- 样品中的黄曲霉毒素M,的含量,单位为微克每千克((lg/kg);
      50 ml样液(7.4)中所含有的乳粉质量数,单位为克(g);
      GB/T 18980-2003
      mn ,V,,vi的含义与1.8.1中所定义的一样。
      式( 3)适用于未经稀释的试样,否则应该乘以稀释倍数。
      计 算结果表示到小数点后三位。
      9 精密度
      各 实验室试验结果的精密度总结于附录A中,这些数据不适用于其他的浓度范围和材质。
      10 测试报告
      测 试报告中应该含有:
      a) 描述样品完整特征所需要的所有信息;
      b) 采样方法,如果知道请写上;
      。) 根据该标准,所采用的试验方法;
      d) 该标准没有提出的其他操作细节,对测试结果可能产生影响的操作、现象以及采取的措施
      e) 测试结果;
      f) 如果检查了重复性,zui终的验证结果。
      2 免疫亲和层析净化荧光光度法

      21 范围
      本方 法 规 定了用免疫亲和层析净化荧光光度法测定乳和乳粉中黄曲霉毒素M,的条件和详细分析
      步 骤。
      本 方 法 适 用 于乳和乳粉中黄曲霉毒素M 的快速测定。乳中黄曲霉毒素M:的检出限为
      0. 1 pg/L,乳粉中黄曲霉毒素M,的检出限为。.l pg/kgo
      22 方法提要
      试样 经 过 离心、脱脂、过滤后,滤液经过含有黄曲霉毒素M,特异性单克隆抗体的免疫亲和层析净
      化,黄曲霉毒素M,交联在层析介质中的抗体上。此抗体对黄曲霉毒素M,具有专一性,当样品通过亲
      和柱时,抗体选择性的与所有存在的黄曲霉毒素M (抗原)键合。用甲醇一水(10+90)将免疫亲和柱上
      杂质除去,以甲醇一水(80+20)通过免疫亲和柱洗脱,加人澳溶液衍生后的洗脱液于荧光光度计中测定
      黄曲霉毒素M,含量。
      23 试剂
      除非 另有 规定,仅使用分析纯试剂、重蒸馏水。
      2.3. 1 甲醇(CH,OH):色谱纯。
      2.3.2 抓化钠(NaCI),
      2. 3. 3 甲醇一水(10+90):取10 mL甲醇加人90 ml_水
      2.3 .4 .甲醇一水(80+20):取80m L甲醇加人20m L水。
      2.3.5 澳溶液储备液(0.01%):称取适量澳,溶于水后,配成。01%的储备液,避光保存。
      2.3.6 嗅溶液工作液(0.00200):取10m L0 .01 %的嗅溶液加人40m l水混匀,于棕色瓶中保存备用
      现用现配。
      2.3.7 二水硫酸奎宁(C,oH z,N zO z·H2S 04·2H20).
      2.3. 8 硫酸溶液(0.05 m ol/L):取2.8m l浓硫酸,缓慢加人适量水中,冷却后定容至10 00m l。
      2.3. 9 荧光光度计校准溶液:称取0.34 0g 硫酸奎宁(C2oH 24N 20 2·H2S认·2H20),用0.05m ol/L
      硫酸溶液溶解并定容至100m L,此溶液荧光光度计读数相当于2.0 p g/L黄曲霉毒素M,标准溶液。
      0.05 m ol/I硫酸溶液荧光光度计读数相当于0.0 F ag/l黄曲霉毒素M-
      2.4 仪器
      2.4. 1 荧光光度计
      2.4. 2 离心机:离心力不低于40 00r /min
      GB/T 18980-2003
      2.4.3 玻璃纤维滤纸:直径11 cm,孔径1.5 pme
      2.4.4 黄曲霉毒素M,免疫亲和柱。
      2.4.5 空气压力泵。
      2.4.6 玻璃试管:直径12 mm.长75 mm,无荧光特性。
      2.4. 7 玻璃注射器。
      2.5 分析步甄
      2.5. 1 样品提取
      2.5.1.1 乳
      取 50 m L乳样品,加人1.0 g 抓化钠,40 00r /min离心力下离心10m in,小心移取用于分析的乳底
      层脱脂部分,不要扰动顶部脂肪层,将脱脂的乳以玻璃纤维滤纸过滤,滤液备用。
      2.5.1.2 乳粉
      称取 5.0 g 乳粉,用30`C^ -60℃水将其慢慢溶解,定容为50m L,加人1.0 g 抓化钠,以下按
      2.5.1.1的步骤操作。
      2.5.2 净化
      将免 疫 亲 和柱连接于10m L玻璃注射器下。准确移取10.0 m L上述滤液注人玻璃注射器中,将空
      气压力泵与注射器连接,调节压力使溶液以约6 mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱,直至2 mL-3 mL
      空气通过柱体。以10 mL甲醉一水(10+90)清洗柱子两次,弃去全部流出液,并使2 mL-3 mL空气通
      过柱体。准确加人1.0 rnL(V,)甲醇一水(80十20)洗脱液洗脱,流速为1 mL/min-2 mL/min,收集全部
      甲醉一水洗脱液于玻璃试管中,备用。
      2.5.3 测定
      2.5.3. 1 荧光光度计校准
      在激 发 波 长360n m.发射波长450n m条件下,以。.05m ol/1硫酸溶液为空白,调节荧光光度计的
      读数值为0.0 la g/L;以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为2.0 la g/L,
      2.5.3.2 样液测定
      取上 述 洗 脱液加人1.0m L(V)0.002%澳溶液,1m in后马上于荧光光度计测定样液中黄曲称毒素
      M,含量c,
      2.5.3.3 空白试验
      用 水 代 替试样,按2.5 .1^-2.5 .3 步骤做空白试验。
      2.6 结.计算
      2.6. 1 乳
      乳检 测 结 果按式(4)计算:
      X,= (c,一Co) XV,X10
      V · ·. ······。,·····..·····.··??(4)
      式中:
      X,-一试样中黄曲霉毒素M,含量,单位为微克每升(pH/L);
      cl-— 荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M:的浓度,单位为微克每升(K4/L);
      ca-- 荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素M:的浓度,单位为微克每升(KB/L);
      V,-— zui终净化甲醇一水洗脱液体积,单位为毫升(mL) ;
      V--一通过亲和柱试样体积,单位为毫升(mL) ;
      10一一仪器的读数系数。
      计算结果表示到小数点后一位。
      GB/T 18980-2003
      2.6.2 乳粉
      乳粉 检 测 结果按式(5)计算:
      X,二
      (c2一CO X V, X 10
      仇义V ··················。·········? ?(5)
      式中:
      Xz— 试样中黄曲橄毒素M、含量,单位为微克每千克(Fig/kg);
      ci- 荧光光度计中读取的样液中黄曲霉毒素M、的浓度,单位为微克每升如g/L;
      ca- 荧光光度计中读取的空白试验中黄曲霉毒素M,的浓度,单位为微克每升伽g/L);
      叭— zui终净化甲醉一水洗脱液体积,单位为毫升(mL;
      V— 通过亲和柱试样体积,单位为毫升(mL) ;
      m- 50 mL试样中所含乳粉的质量数,单位为克每毫升(g/mL) ;
      10— 仪器的读数系数。
      计算结果表示到小数点后一位。
      GB/T 18980--2003
      附 录 A
      (资 料 性 附 录 )
      多个不同实验室的试验结果
      世 界各 地 16个实验室参加了低脂肪(I%)和高脂肪(28 )乳粉样品的协同试验。高脂肪样品是用
      于制作参比物质的剩留物[4口,所以黄曲霉毒素M,的含量是已知的。
      对于 乳 粉 ,其污染水平为。08p g/kg--0.6 p g/kg,即对于乳而言,污染水平为8n g/L-60n g/I.
      试验 结 果 根据ISO 5725-1和ISO 5725-2仁2;3〕规定的统计方法获得,其精密度的数据列于表A.1
      (注:试验数据来自于参考文献「5〕和「6]).
      表 A .1 箱 密 度 数 据
      样品编号1 2 3 4 5
      实验室个数12 4 l3 11 14
      平均值/(ng/kg) 81 150 80 202 580
      重复性值。/(ng/kg) 23 60. 1 15 27 203
      再现性值R/(ng/kg) 52 98 41 61 310
      重复性变异系数/(%) 9. 9 14.0 6. 8 4. 7 12. 5
      复验性变异系数/(写) 23 22. 7 18. 3 10.8 19. 1

      减少的实验室数是根据Cochran和Grubbs统计方法应该从样本中剔除的数据

       

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