太阳成集团官网

太阳成集团官网  ◇  技术支撑  ◇  蛋白质浓度测定(双缩脲法)实验先容
蛋白质浓度测定(双缩脲法)实验先容
  • 发布日期:2016-04-22     信息来源:      浏览次数:2957
    • 实验原理

      测定蛋白质的定量方法有很多,目前常用的有凯氏定氮法;比色法主要包括双缩脲法、Folin-酚试剂法及 染料结合法;紫外分光光度法等
      双缩脲(Biuret)法:在碱性溶液中,双缩脲(H2N—CO—NH—CO—NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物,这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO—NH2),或与此相似的基团[如—CH2—NH2,—CS—NH2,—C(NH)NH2]的任何化合物,无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连,均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO—NH—),可发生双缩脲反应,且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比,可用比色法测定蛋白含量。与同样处理的蛋白标准液比较,经计算或查标准曲线即可求出血清总蛋白质含量。
      实验试剂

      1.6mol/L氢氧化钠溶液  
      称取氢氧化钠(NaOH,优级纯)240g,用新鲜蒸馏水配制成1L,置室温贮存在密封的聚乙烯瓶里。
      2.双缩脲试剂  
      称取未失结晶水的硫酸铜(CuSQ·5H20) 3.0g,溶于500m1新鲜蒸馏水中,加酒石酸钾钠(NaKC4H4O6.4H2O)9.0g,碘化钾(KI)5.0g,待安全
      溶解后,加入6mol/L氢氧化钠溶液100ml,zui后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里,约稳定6个月。
      3.蛋白标准液 
      可用商品血清蛋白标准液或定值质控血清为标准。亦可收集混合新鲜血清,用凯氏定氮法标定后,加叠氮钠防腐(叠氮钠的终浓0.5~1.0g/L),冰冻
      保存。
      实验设备

      恒温水浴箱、722(721)分光光度计、吸管、试管、坐标纸
      实验步骤

      1.   配制20g/L蛋白标准液  如蛋白标准液浓度为70g/L,则取此液2m1,加入新鲜蒸馏水5ml,混匀即成。
      2.   按表操作
       
          加入物(ml)  空白管   1    2    3    4    5 测定管
      20g/L蛋白标准液     ~    0.1    0.2   0.3       0.4       0.5        ~   
      蒸馏水    0.5    0.4    0.3   0.2    0.1   ~      0.4
      待测样品液体   ~     ~    ~       ~     ~      ~        0.1
      双缩脲试剂     3.0   3.0     3.0       3.0        3.0       3.0       3.0     
      相当血液蛋白质(g/L)      ~      20    40    60    80   100    
      混匀,置37℃水浴10min(或25℃30min),用540nm波长比色,以空白管调零,读取各管吸光度。
      3.   标准曲线绘制
      1—5为标准曲线管,测得吸光度后,以吸光度为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
      4.   实验结果
      根据测定管吸光度,从标准曲线查找相对应的总蛋白浓度。 
       
      注意事项

      1.双缩脲试剂中,加入酒石酸钾钠,Cu2 形成稳定的络合铜离子,以防止CuSO4·5H20不稳定形成Cu(OH)2沉淀。酒石酸钾钠与CuSO4·5H20之比
            不低于3:1,加入KI作为抗氧化试剂。
      2.双缩脲试剂要封闭贮存.防止吸取空气中的二氧化碳。
      3.本法各种蛋白质的显色程度基本相同,重复性好,几乎不受温度影响,*缺点是灵敏度较低。
      4.黄疸血清.严重溶血对本法有明显干扰。

      5.本法绘制的标准曲线是一条通过原点的直线,在100g/L浓度之内呈良好的线性关系。

       

      上海太阳成集团官网有限企业专业生产:紫外分析仪、三用紫外分析仪、暗箱式紫外分析仪、暗箱三用紫外分析仪、暗箱紫外分析仪、手提式紫外分析仪、三用紫外分析仪暗箱式、紫外检测仪、部分收集器、恒流泵、蠕动泵、太阳成集团官网、太阳成集团官网、化学发光成像分析系统、光化学反应仪、旋涡混合器、漩涡混合器、玻璃层析柱、梯度混合器、梯度混合仪、核酸蛋白检测仪、玻璃层析柱、荧光增白剂测定仪、馏分收集器、切胶仪、蓝光切胶仪、层析系统等产品。咨询。

    在线客服
    在线客服
    在线客服
    在线客服
    在线客服

    电话咨询

    4000-123-925
    在线客服
    XML 地图 | Sitemap 地图
    扫一扫访问手机站扫一扫访问手机站
    访问手机站