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细菌蛋白提取与纯化的实验手册
  • 发布日期:2016-07-27     信息来源:      浏览次数:2432
    • 不同的蛋白质分离纯化的方法不同,但蛋白质分离纯化的操作步骤基本类似,那么如何进行细菌蛋白的提取呢?这里总结细菌蛋白的提取的实验试剂、操作步骤以及一些注意事项。
      实验试剂
      采用T7• Tag Affinity Purification Kit
      T7•Tag抗体琼脂。B/W缓冲液:4.29mM Na2HPO4,1.47 mM KH2PO4,2.7 mM KCl, 0.137mM NaCl,1%吐温-20,pH7.3 洗脱缓冲液: 0.1M柠檬酸,pH2.2. 中和缓冲液:2M Tris,pH10.4。 PEG 20000。

      实验步骤
      1.100ml 含重组表达质粒的菌体诱导后,离心5000g×5min,弃上清,收获菌体,用10ml预冷的B/W缓冲液重悬。
      2. 重悬液于冰上超声处理,直至样品不再粘稠,4℃离心 14000g×30min,取上清液,0.45μm膜抽滤后作为样品液。
      3. 将结合T7•Tag抗体的琼脂充分悬起,平衡至室温,装入层析柱中。
      4. B/W缓冲液平衡后样品液过柱。
      5. 10ml B/W缓冲液过柱,洗去未结合蛋白。
      6. 用5ml洗脱缓冲液过柱,每次1ml,洗脱液用含150μl中和缓冲液的离心管收集,混匀后置于冰上,直接SDS-PAGE分析。
      7. 将洗脱下来的蛋白放入透析袋中,双蒸水透析24hr,中间换液数次。
      8. 用PEG 20000浓缩蛋白。
      注意事项
      蛋白在过层析柱前,要0.45μm膜抽滤,否则几次纯化后,柱子中会有不溶物。

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